Revista de Biología Marina y Oceanografía
Vol. 48, No3: 511-520, diciembre 2013
DOI 10.4067/S0718-19572013000300009
ArtículoComposición y abundancia de comunidades microbianas asociadas al biofloc en un cultivo de Tilapia
María del C. Monroy-Dosta, Germán Castro-Mejía, Ramón De Lara-Andrade, y Mauricio G. Coelho-Emerenciano, Jorge Castro-Mejía
Resumen.
El objetivo de este trabajo fue identificar y estimar la abundancia de microorganismos asociados a un sistema de cultivo biofloc desarrollado a partir de un sistema del tipo ‘macrocosmo-microcosmo’. En la primera sección (cilindro de 1000 L), se colocaron 75 tilapias con una longitud aproximada de 5,0 ± 0,95 cm y un peso promedio de 4,2 ± 1,08 g. Los peces fueron alimentados diariamente con una dieta comercial, manteniendo una relación C/N= 15:1, mediante el aporte controlado de carbono (melaza y pulido de arroz) y nitrógeno (proveniente del alimento comercial). Esta condición fue mantenida durante 14 semanas. Se identificaron los diversos microorganismos asociados a los folículos, utilizando pruebas microbiológicas convencionales. Se determinó la abundancia de los organismos asociados a los folículos utilizando microscopio óptico y estereoscópico, ambos conectados con el programa de imágenes y de conteo (Image ProPlus v.7.0). Los resultados obtenidos indican cambios en la abundancia de las diversas comunidades de organismos asociados a los flóculos durante las 14 semanas del experimento. Los principales grupos encontrados fueron: bacterias, microalgas, ciliados, rotíferos y nematodos. Los resultados confirman que los flóculos contribuyen como fuente de alimento natural in situ, debido a que gran cantidad de organismos pueden estar asociados incluyendo comunidades microbianas heterótrofas de los géneros Sphingomonas, Pseudomonas, Bacillus, Nitrospira, Nitrobacter y la levadura Rhodotorula sp. La bibliografía menciona que estos microorganismos favorecen la calidad del agua y el bienestar fisiológico de los organismos en cultivo.
INTRODUCCIÓN
En las últimas décadas dentro del sector acuícola, se han diseñado una serie de sistemas de producción para el cultivo de diversos organismos acuáticos, orientados a disminuir la utilización del agua y del espacio, aumentando considerablemente la densidad de cultivo (Timmons et al. 2002, Hargreaves 2006). Un ejemplo interesante de este tipo de sistemas, es el denominado biofloc, el cual consiste en el desarrollo de flóculos microbianos formados a partir de una alta relación carbono:nitrógeno en el agua, con poco o nulo recambio y alta oxigenación (Avnimelech 2012, Emerenciano et al. 2013), en los cuales se utilizan dietas con bajo contenido de proteína cruda (Azim & Litle 2008) o fuentes de carbono externo tales como melaza (caña de azúcar) salvado de arroz, salvado de trigo, entre otros (Emerenciano et al. 2012), lo que permite el crecimiento de una comunidad microbiana, sobretodo de bacterias heterótrofas, que metabolizan los carbohidratos y toman nitrógeno inorgánico (principalmente NH4 reduciendo sus niveles y mejorando la calidad del agua (Crab et al. 2009). Por otra parte, asociados a estos flóculos se han observado microalgas, zooplancton, coloides, polímeros orgánicos, cationes y células muertas que son consumidas por las especies cultivadas como fuente de proteína, por lo que los costos de alimentación se reducen en más del 25% (Avnimelech 2006, De Schryver et al. 2008, Ekasari et al. 2010). En relación a técnicas para la caracterización de los microorganismos en sistemas Biofloc, Ray et al. (2010), señalan 3 métodos: microscopia, epiflorescencia y cromatografía de gases. La técnica más utilizada es la visual mediante microscopia, la cual permite determinar los principales grupos de microorganismos en los flóculos (Newall et al. 2006). La identificación de los componentes microbianos vinculados a los flóculos se reporta, sobre todo a nivel de grupo, sin llegar a género debido principalmente a la falta de precisión en la identificación. De acuerdo con Emerenciano et al. (2012) la calidad nutricional del biofloc puede variar substancialmente de 12 a 49 y 13 a 46% de proteína cruda y lípidos, respectivamente. La misma tendencia puede ocurrir con los niveles de PUFA y HUFA (Azim & Litle 2008, Ekasari et al. 2010), estas variaciones pueden ser resultado de una diferente relación C:N, intensidades de luz, salinidad y sobretodo, de la conformación de la microbiota. Por lo anterior, es necesario realizar estudios que además de conocer la composición microbiana, permitan identificar los diversos grupos a lo largo del cultivo para determinar la diversidad de alimento vivo disponible para los peces y camarones, por lo que el objetivo de esta investigación fue identificar la comunidad microbiana en un cultivo biofloc y los cambios que se presentan en su composición a lo largo de un ciclo de cultivo.
MATERIALES Y MÉTODOS
DISEÑO EXPERIMENTAL
Para llevar al cabo el experimento se diseñó un sistema del tipo ‘macrocosmo-microcosmo’ (Wasielesky et al. 2006, Emerenciano et al. 2011), que consistió de 2 secciones: la primera con un contenedor de fibra de vidrio circular de 1000 L de capacidad (macrocosmo), con un difusor de aire en el centro para garantizar el movimiento continuo y resuspensión de partículas; y la segunda sección formada por 5 tinas circulares de 250 L cada una (microcosmos) (Fig. 1), ambas unidades conectadas con un sistema de recirculación por medio de 2 bombas eléctricas de 1.0 HP.
Figura 1. Sistema de recirculación utilizado en la producción de biofloc
CONFORMACIÓN DE BIOFLOC
En la primera sección (cilindro de 1000 L), se colocaron 75 tilapias con una longitud de 5,0 ± 0,95 cm y un peso promedio de 4,2 ± 1,08 g, a las cuales se les proporcionó diariamente un alimento comercial formulado para la especie (Alimentos del Pedregal®) con 45% de proteína un tamaño de 0,6-0,8 mm (migaja 1), suministrando el 10% de su masa corporal y ajustando la cantidad cada 15 días.
Para garantizar un crecimiento bacteriano adecuado, se mantuvo una relación C/N= 15:1 (Avnimelech 2012), mediante el aporte controlado de carbono (melaza y pulido de arroz) y nitrógeno proveniente del alimento comercial. Esta condición fue mantenida durante 14 semanas.
MONITOREO DE LAS COMUNIDADES MICROBIANAS
AISLAMIENTO BACTERIANO
Para realizar el conteo y caracterización de las comunidades bacterianas se utilizó el método propuesto por APHA (1992). A partir de la formación de los pequeños flóculos en el sistema, cada semana se tomaron muestras de 2 g que se inocularon en 90 mL de solución salina estéril y se efectuaron diluciones 1:10, de las cuales se sembró 0,1 mL en placas de agar MSR (Man-Rogosa Sharpe), BHI (Infusión Cerebro-Corazón), TCBS (Tiosulfato-Citrato-Sales Biliares) y TSA (Tripticasa-soja), por triplicado. Las placas se incubaron a 27°C durante 24 h. Transcurrido este periodo, se efectuó el conteo de las unidades formadoras de colonias/mL y se caracterizó la morfología colonial; posteriormente a través de resiembras sucesivas las cepas fueron purificadas. La tinción de Gram se utilizó para observar la morfología celular con ayuda de un microscopio óptico (ZSX50 Olympus®). Este procedimiento se llevó a cabo durante 14 semanas. A las cepas aisladas se les efectuaron pruebas microbiológicas convencionales para su identificación como: catalasa, oxidasa, óxido fermentación, movilidad e indol (Bergey & Holt 1994). Finalmente, se confirmó la identificación de las cepas con el sistema API20E, API20NE, APICHL, API CHL 50 y el Programa ApiwebTM Biomerieux.
DIVERSIDAD DE LAS MICROALGAS Y MICROFAUNA ASOCIADA AL BIOFLOC
Para la observación y cuantificación microscópica de los organismos asociados a los flóculos microbianos, se tomaron muestras de agua cada semana. En el caso de las microalgas se transfirió 1 mL de muestra a una cámara Sedgewick-Rafter (Azim & Little 2008), y se observó con un microscopio ZSX50 Olympus®, con objetivo de 100X conectado a un programa de imágenes; se procedió a contabilizar 4 campos escogidos al azar de la cámara de recuento.
Para la identificación de la microfauna (ciliados, rotíferos, nematodos) se tomaron 3 muestras de 10 mL de agua que se fijaron con formalina al 5%, las cuales se observaron y contabilizaron de manera directa. Los microscopios utilizados estaban conectados al programa de imágenes y de conteo (Image® Pro Plus 7.0). La identificación taxonómica de los grupos observados se efectuó a nivel de género con ayuda de literatura especializada (Aladro-Lubel 2009).
RESULTADOS
Los resultados obtenidos indican variaciones entre las diversas comunidades de organismos que se encuentran asociados al biofloc, dentro de los principales grupos observados se encuentran: microalgas, ciliados, rotíferos, nematodos, bacterias y la levadura Rhodotorula sp. (Fig. 2, Tabla 1).
BACTERIAS Y LEVADURAS
En la tabla 2 se muestran las especies microbianas identificadas. A partir de la tercera semana, se identificaron habitantes comunes del ambiente acuático como son los géneros Aeromonas y Vibrio que después de la séptima semana no fueron detectados en el sistema. En la cuarta semana, se establecieron comunidades microbianas heterótrofas con alta capacidad de degradar materia orgánica, como bacterias de los géneros Sphingomonas, Pseudomonas y Bacillus y la levadura Rhodotorula sp. La bacteria filamentosa Microthrix sp. relacionada con la formación de flóculos se identificó en la quinta semana. Entre los grupos bacterianos que dominaron el sistema después de la sexta semana se encontraron bacterias encargadas de la transformación del nitrógeno en el ambiente acuático como Nitrospira sp. y Nitrobacter sp. y Bacillus sp.
MICROALGAS
A partir de la tercera semana se inició la colonización de microalgas en el sistema, aún cuando no se observó la formación de flóculos (Fig. 3). El primer grupo que apareció fue el de las clorofitas que permanecieron hasta la semana 14 del experimento. Sin embargo, son las diatomeas las que mantienen conteos mayores a partir de la octava semana y hasta el final del experimento. Es importante señalar que las diatomeas siempre se observaron muy adheridas a los flóculos. Las cianobacterias sólo estuvieron presentes entre la séptima y novena semana con conteos inferiores a 80 cel mL-1.
CILIADOS
En relación a los ciliados se observó que los géneros que aparecieron a partir de la tercera semana fueron Paramecium, Colpidium y Stylonychia, permaneciendo Colpidium hasta el final del experimento (14 semanas). Los géneros Vorticella, Epystilis y Halteria sólo se mantienen de 5 a 10 semanas
ROTÍFEROS
Entre los rotiferos, el género Philodina fue el grupo dominante a lo largo del experimento, con conteos iniciales menores de 20 org. mL-1 pero incrementándose de tal manera que para la sexta semana alcanzaron una población de casi 200 org. mL-1 para después estabilizarse con conteos superiores a 115 org. mL-1 (Fig. 5). El género Lecane apareció a partir de la tercera semana (80 org. mL-1), permaneciendo hasta la séptima (24 org. mL-1), cuando el género Keratella se incrementa (45 org.mL-1), pero este último sólo se registró durante 5 semanas, con una concentración final de 23 org. mL-1.
NEMATODOS
En la cuarta semana del experimento se observó la presencia de nematodos con una densidad de 25 org. mL-1, justo cuando los flóculos alcanzaron aproximadamente 1 mm de diámetro. El pico máximo fue observado en la séptima semana (125 org. mL-1), para estabilizarse en el sistema en las semanas posteriores (Fig. 6).
DISCUSIÓN
Los resultados obtenidos en este estudio indican variaciones entre las diversas comunidades de organismos que se encuentran asociadas al biofloc. En relación a la composición bacteriana adherida a los flóculos, los primeros géneros identificados fueron Aeromonas y Vibrio que son habitantes comunes de ambientes acuáticos y proliferan sobre todo si hay sobrecarga de materia orgánica (Austin et al. 1995, Fuentes & Pérez 1998). La problemática con estos géneros es que frecuentemente se muestran virulentos y causan enfermedades en diversos organismos acuáticos (Álvarez & Austin 2000). Sin embargo, el incremento de microorganismos heterótrofos como Sphingomonas paucimobilis, Pseudomonas luteola, Pseudomonas mendocina, Bacillus sp. Micrococcus sp. y la levadura Rhodotorula sp., posiblemente impidieron la proliferación de los géneros Aeromonas y Vibrio de tal manera que no se encontraron después de la octava semana. Este comportamiento de disminución e inclusive desaparición, también lo señalan Wu et al. (2012), quienes mencionan que uno de los beneficios en el uso del biofloc es la capacidad de exclusión competitiva que tienen ciertas poblaciones bacterianas heterótrofas sobre bacterias patógenas.
La presencia de las bacterias degradadoras de nitrógeno como Nitrospira sp., Nitrobacter sp. y Bacillus sp., es benéfico, porque estos géneros están asociados a un mejor mantenimiento de la calidad del agua de cultivo Hargreaves (2006). Avnimelech et al. (1999, 2009) y Crab et al. (2012), señalan que estos grupos son dominantes en este tipo de sistemas, logrando un biocontrol efectivo sobre microorganismos patógenos.
